大多数精神障碍的特点是认知功能和行为控制能力受损。由于精神障碍通常具有慢性复发性，且缺乏有效的治疗方法，因此有必要开发新的治疗策略。具有多种传感和刺激能力的脑机接口提供了一个新的工具箱，但其在诊断和治疗精神障碍方面的适用性尚未得到探索。在这里，我们开发了一种软性多模态神经假体，用于测量和调节神经精神症状的前额叶神经生理特征。我们将该装置植入大鼠内侧前额叶皮层的硬膜外上方，获得了听觉事件相关脑电位，反映了完整的神经刺激处理和酒精引起的神经损伤。此外，植入驱动的电刺激和药物刺激成功地调节了神经活动。最后，我们开发了机器学习算法，该算法可以处理数据稀疏性问题，并能高精度区分影响。我们的工作强调了多模态生物电子系统在实现个性化和优化治疗方面的潜力。

一、简介

前额叶皮层（PFC）是自上而下控制行为的基本结构，调节注意力、工作记忆、奖赏评估和行为。前额叶皮层（PFC）是自上而下控制行为的基本结构，它调节注意力、工作记忆、奖赏评估以及自我控制行动、情绪和压力的能力。前额叶神经网络活动的紊乱是神经精神疾病（如成瘾性疾病、精神分裂症或自闭症）中许多认知和行为障碍的根源。这些疾病的病因复杂，因此最佳治疗方法具有挑战性。目前的治疗干预措施往往会产生副作用，而且缺乏长期疗效。特别是，全身性药物疗法的局部特异性较差，无法适应患者在治疗时间和强度方面的具体需求变化。因此，治疗后的长期复发和高复发率需要开发新的治疗方法。

脑刺激技术，如脑深部刺激（DBS）和经颅直流电刺激（TBS经颅直流电刺激（tDCS）等脑刺激技术作为替代性治疗方案日益受到关注。DBS 可以通过深度植入的电极精确地传递到特定的大脑区域。DBS 主要用于帕金森病，以改善运动功能，同时也对神经精神疾病，如抑郁症、药物成瘾以及强迫症和焦虑症产生有益影响。然而，由于其侵入性和持续刺激模式，DBS 有可能产生副作用，如言语、步态和认知能力受损，因此仅限于少数严重和对治疗病例。与此相反，tDCS 是一种应用于头皮的非侵入性脑部刺激，没有副作用或副作用极小。前额叶 tDCS 已被证明可以减轻抑郁症状和精神分裂症状，以及药物使用障碍患者的渴求和药物消耗。然而，有报告称，不同的治疗然而，有报告称 tDCS 的疗效各不相同，这可能是由于对所有受试者使用了相同的刺激参数，采用了僵化的 “一刀切 ”方式，没有考虑到大脑解剖结构、潜在病理和大脑状态的时间变化等个体差异。此外，高达约 75% 的颅内外加电流会被头皮和颅骨衰减，从而阻碍了对目标的刺激。和头骨的衰减，从而影响了目标区域和剂量的确定。

配备多种传感和刺激能力的皮质神经义肢可能会为诊断和治疗提供一个新的非主流工具箱，并可能克服当前脑刺激技术的一些局限性。皮质上或皮质下植入的装置由柔软的生物相容性材料制成，可适应大脑皮质的弯曲。与脑穿透电极相比，皮质外电极可适应大脑的曲线表面，从而减少组织炎症并提高长期稳定性。此外，通过小型表面电极直接刺激大脑皮层可在靠近目标结构的地方提供有效而精确的刺激。此外，皮质外神经假体可将神经监测和刺激结合在一个设备中，从而立即检测刺激对神经活动的影响。目前，皮质外电极用于皮质电图（ECoG）和直接皮质刺激的临床应用主要集中在实时脑功能图谱，以评估药物难治性癫痫和脑肿瘤手术干预期间的语言、运动和感觉功能。除了术中癫痫发作定位外，结合直接皮层刺激的心电图类型阵列也已成功应用于以下方面。除了术中癫痫发作定位外，心电图型阵列与直接皮层刺激相结合的方法也已成功实施，通过检测随后触发刺激的异常神经活动来减少癫痫的初期发作。这种所谓的响应式神经刺激系统是首个获准用于临床应用的真正双向闭环脑机接口。

二、方法

通过利用人工智能和先进的机器学习算法来识别大脑状态，并根据预先定义的神经特征优化刺激参数，闭环神经调控技术还可能为治疗神经精神疾病带来机遇。事件相关电位（ERPs）是符合这一目的的生物标记。这些在外部或内部事件发生后立即在大脑中诱发的短暂电偏转这些在外部或内部事件发生后立即在大脑中引发的短暂电偏转已被证明对研究健康人和精神病理状态下的感官信息处理和高阶认知非常有价值 。在头皮记录的脑电图（EEG）中，ERPs 表现为持续数十至数百毫秒（ms）的几微伏（µV）的时间锁定局部负或正最大值。它们通常根据极性（负=N，正=P）和潜伏期（以刺激后毫秒或记录波形中的出现顺序为单位）。最著名的激发 ERP 的范式是 “奇异球 ”范式，在该范式中，受试者面对一系列频繁出现的（如听觉或视觉）刺激（“标准”），其中随机穿插稀有刺激（“异类”）。在这类任务中观察到的常见 ERP 成分包括 P1、N1、P2、N2 和 P3。成分 P1、N1 和 P2 反映了注意前和注意早期的自动刺激处理和感觉门控，它们构成了一种抑制性过滤机制，可使注意力集中在突出刺激上，同时忽略无关或重复的信息。N2 是由罕见事件引起的，反映了对新颖性和刺激概率敏感的变化检测反应。同样，P3 的振幅随刺激的发生率和重要性而变化，但也取决于受试者的动机、注意力资源和认知能力。修改后的 ERP 显示与神经精神疾病相关的 PFC 功能受损和认知障碍。与神经精神疾病有关的认知缺陷。例如，在酒精成瘾患者和动物模型中观察到延迟和/或降低的 ERP 振幅。P3 分量的紊乱主要与行为控制能力差和复发几率增加有关，因此被认为是预测戒毒后复发风险的合适指标。戒毒后的复发风险。

通过头皮电子脑电图测量的 ERP 具有较高的时间精度，但缺乏空间分辨率，对噪声敏感，而且与 tDCS 一样，电信号通过头骨被部分消音。ECoG 电极更接近相关大脑活动的源头，信号灵敏度更高，带宽更宽、与脑电图相比，心电电极具有更高的信号灵敏度、更宽的带宽、更高的地形分辨率和更低的伪差，因此能准确采集 ERP。迄今为止，ECoG 电极一直被放置在外侧的感觉运动区，这是基于癫痫发作的临床要求。或使瘫痪患者能够利用与运动相关的神经活动模式控制外部设备。然而，皮质外上皮层植入物针对前额叶中枢脑区认知ERP的潜力仍有待探索。

基于植入式双向脑机接口的优势和机遇，我们着手建立一个量身定制的软性多模态皮质外上皮层设备，以测量和调节与神经精神疾病的诊断和治疗相关的神经生理特征。我们在大鼠内侧（m）PFC上方硬膜外植入了这一装置，并测试了其获取听觉ERPs的可行性。我们检测了急性酒精摄入以及直接应用电脉冲和药效纳曲酮（NTX）进行植入驱动神经调控所诱发的活动改变。此外，我们还利用机器学习算法从单次ERP试验中分辨出治疗特异性的从单次ERP试验中分辨出特定治疗的大脑反应，并将其作为治疗性神经假体中神经刺激闭环调整的潜在反馈。最后，我们对植入物和干预的耐受性进行了免疫组化分析。

三、结果

3.1 开发并植入皮质上皮神经假体以连接PFC

我们最初开发了一种定制的植入式装置，覆盖大鼠大脑皮层额叶表面。植入的电极以 3 x 3 矩阵排列，并根据其在 mPFC 上的位置标记为：前中央（FC）、前左（FL）、前右（FR）、内侧中央（MC）、内侧左（ML）、内侧右（MR）、后中央（PC）、后左（PL）和后右（PR）。其中八个电极(0.2 × 0.2平方毫米）仅用于神经记录。较大的 FC 电极（1 × 1 平方毫米）用于记录和电刺激前囟前 3.2 毫米处横跨两个半球的 mPFC。在前囟前 2.2 毫米处集成了一个微流控通道，用于局部输送液体。我们使用了一种最近建立的原型技术，该技术可以快速制造出柔软的定制生物电子植入物。因此，阵列是用软硅树脂和导电材料逐层 3D 打印出来的。(图 1 A-C）。体外测量 1 kHz 时的电极阻抗为 10.14 ± 1.96 kΩ （平均值 ± 平均值标准误差）。(平均值 ± 平均值标准误差 (SEM)），刺激电极为 4.36 ± 1.41 kΩ（10 个植入体中的 10 个）（图 1 D、图S 1、表 S 1）。

生物电子装置经硬膜外植入 10 只大鼠的 mPFC（图 1 C）上方。上矢状窦和邻近血管。虽然无法避免偶尔的微量出血，但我们注意将钻孔时间限制在每次几秒钟，钻头转速较低，并用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）持续冲洗，以防止热组织损伤。为了让 NTX 溶液流入，在微流控通道位置旁边的硬脑膜双侧切开约 0.5 毫米。

对植入物在体内的稳定性进行了长达 3 周的评估，在此期间，每隔三天测量一次单个电极的阻抗。随着时间的推移，记录电极的阻抗总体呈上升趋势，而刺激电极的阻抗则保持稳定（图 1 D，表 S 1）。阻抗低于 600 kΩ 即为适合进一步进行 ERP 分析的功能电极。在整个研究期间，超过 80% 的电极保持功能正常（表S 1）。其中一个刺激电极在最后一次治疗的时间点失去了功能。

图1. 用于记录和调制神经活动的多模态皮质上皮细胞阵列。

（A） i) 硅胶底层（DOWSIL™ SE1700），包括定义电极活性位点和微流体通道的孔洞；ii) 第二层硅胶层定义电极互连和微流体通道的边界；iii) 阵列的导电部分由铂硅复合材料喷墨打印而成。iv) 微导线的连接 v) 硅流体通道的连接 vi) 使用 SYLGARDTM184 对阵列进行隔离 vii) 使用 DOW CORNING 734 对电缆触点进行隔离 (B) 植入体的照片 (C) 将阵列植入 mPFC，包括前脑皮层 (ACC)、边缘前皮层 (PrL) 和边缘下皮层 (IL)。立体定向坐标（以毫米为单位）相对于前囟。(D)记录电极（蓝色，n = 80 个电极，共 10 个植入体）和刺激电极（红色，n = 10 个电极，共 10 个植入体）体外（1 kHz）和体内（不同植入体数量，见表 S 1.）的阻抗。数据以平均值 ± SEM 表示。

3.2 对前额叶皮质活动进行心电图测量

我们的目的是确定我们的技术是否能够可靠地获得清醒大鼠（n = 10）的ERP特征。我们使用了与人类ERP研究类似的听觉怪球范式来诱发典型的声音特异性ERP反应。为了减少运动伪差，我们将大鼠吊在有电屏蔽和隔音的测听室（图 2）中。在 5 × 5 分钟的过程中，大鼠被动聆听一系列频繁出现的标准声音（50 毫秒、1 千赫、70 分贝声压级 (SPL)，1200 次 = 87% 的试验），这些声音每秒出现一次，并随机穿插一些罕见的异常声音（50 毫秒、2 千赫、80 分贝声压级，180 次 = 13% 的试验）。

图2. 心电图记录环节的设置和时间表。

实验计划采用受试者内设计，所有动物在未接受治疗（假）的情况下接受初始适应期、手术干预和神经记录，然后按照随机顺序接受酒精注射、脑电刺激和皮层 NTX 给药。通过Intan RHD2000 记录系统以 3 kHz 的采样率对听觉怪球任务中激发的电位进行放大和数字化，并使用英坦记录软件在计算机上进行可视化和保存。

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首先对采集的神经数据进行预处理，包括过滤、数据分割和剔除伪影，然后对每只动物的标准试验和偏差试验求平均值。然后，将ERP振幅计算为刺激后峰值潜伏期周围10毫秒时间窗口内的平均值：P1：30 - 75 ms，N1：80 - 105 ms，P2：110 - 125 ms，N2：130 - 180 ms，P3：200 - 500 ms。由于在此观察到 P2 正分量处于负值范围，因此例外地使用 N1-P2 峰峰差来计算 P2 振幅。

对标准声音和偏差声音的感知所依赖的神经活动的差异应导致通过植入体记录到的电压波形不同。为了确定两种声音的神经反应是否能在心电图记录中区分开来，我们使用通道单样本 t 检验进行了统计分析。差异曲线（异常值减去标准值）与零值进行 t 检验。这些对比得出的 p 值进行了多重比较的事后校正，并附加了以 FDR（错误发现率）调整后的 p 值报告。所有动物的ERP总平均值显示，两种声音引起的神经活动存在显著差异，所有电极部位的P1、N1和P3分量的效应大小较大，也进行了FDR校正（图3，表S 2）。成分虽然在某些通道检测到这些时间间隔内存在显著差异（例如，FL 电极，P2：t(9) = 2.318，p = 0.046（未校正）；N2：t(9) = -2.514，p = 0.033（未校正）），但经不起 FDR 校正。

图3. 标准声音（蓝色）、偏差声音（红色）和它们的差值在所有电极点引起的总平均ERP曲线（黑色）。迹线为 10 只动物的平均值。分量 P1-N1-P2是注意前和注意早期听觉信号处理的特征，而 N2 和 P3 则表示有意识的刺激评估。

3.3 神经活动的电学和药理学调节

在未接受治疗的动物（假）成功获得ERPs后，我们测试了是否能检测到急性全身性酒精给药以及电刺激和NTX（均通过植入体直接作用于大脑皮层）诱导的神经活动变化。每次干预后，动物都要接受同样的听觉怪球任务。由于连接器、粘合剂粘连或微流控通道堵塞等问题，无法对所有动物进行干预，因此这些动物必须退出研究。在每种处理条件下，动物对标准声音的神经反应都显得平淡无奇，这与未处理动物的情况一样（可能是由于高重复率造成的习惯化效应）。因此，为了关注治疗引起的神经活动变化，随后对 ERP 差异曲线进行了分析(差异曲线）进行分析。动物在记录前约 20 分钟接受低剂量（1.5 克/千克，n = 6）或高剂量（3.0 克/千克，n = 9）乙醇（EtOH，20 % v/v，腹腔注射，i.p.）。在行为上，低剂量会诱发轻微的蹒跚步态，而高剂量则会导致共济失调和行动不便。共济失调和不动。配对 t 检验显示，低剂量乙醇条件下四个通道的 N2 分量延迟，但对 ERP 振幅无显著影响（图4、图 S2、表 S3 和 S4）。相反，高剂量乙醇会显著损害神经功能，表现为 N1 分量减弱（图 4，图 S2，表 S6）。对高剂量乙醇的ERP潜伏期分析是针对P1分量进行的（表S6），因为其他ERP分量完全被抑制。

接下来，我们通过双相电荷平衡脉冲（20 分钟，阳极 100 微安/阴极 80 微安，130 赫兹）研究了直接刺激大脑皮层对神经活动的影响，因为这种波形已被证明能在有效激活神经和不利影响（如组织损伤和铂电极溶解）之间提供良好的折衷。动物（n = 8）在受到刺激后没有表现出行为变化，但六个通道的 P1、N1 和/或 N2 振幅增加，表明电刺激对大脑活动有增强作用（图4、图 S3、表 S8）。就 N1 分量而言，与后部电极部位相比，这种效应在更靠近刺激部位时更为明显，这一点可通过使用前部（t(6) = -4.703，p = 0.003，|d| = 0.936）和中排电极（t(6) = -3.139，p = 0.020，|d| = 0.516）的平均 N1 反应组合进行配对 t 检验来揭示（图 4 B）。ERP潜伏期没有变化（表S 7.）。

最后，我们研究了皮质上皮层给药 NTX 的效果，NTX 是一种阿片受体拮抗剂，在康复中已得到广泛应用，但在传统的口服应用中效果一般。我们测试了三种不同的剂量（3 微克（NTX3，n = 5）、6 微克（NTX6，n = 4）、30 微克（NTX30，n = 5）），它们溶解在人工脑脊液中，通过集成微流控通道以 1 微升的体积给药。在施用任一测试剂量的 NTX 时，均未观察到动物行为的差异。

动物行为的差异。3 微克/微升和 30 微克/微升的 NTX 会降低 P1 和 N1 分量的潜伏期（表 S9、S13），所有浓度的 NTX 都会增强 N1、P2、N2 或 P3 分量的振幅（图4、图 S4、表S10、S12、S14）。然而，在对 3 微克/微升（通道 FC、MC、FL、ML）和 30 微克/微升（通道 FC、FL）的 N1 振幅，以及 30 微克/微升后通道 FL 的 P2 振幅。

图4. 酒精和植入式脑电刺激及药物刺激对前额叶神经活动的影响(图 4 酒精和植入式脑电刺激及药物刺激对前额叶神经活动的影响FC 处的代表性总平均偏差-最小值-标准 ERP 差值曲线，包括 1.5 g/kg 的酒精（n = 6，玫瑰色）和 3 g/kg 的酒精（n = 9，红色）、脑电刺激（n = 8，黄色）、3 µg/µl 的纳曲酮（NTX）皮质给药（n = 5，浅蓝色）、6 微克/微升（n = 4，中蓝色）和 30 微克/微升（n = 5，深蓝色）以及未经处理的动物（假阳性，n = 10，黑色）。(B）干预动物和未干预动物在所有通道的ERP振幅差异。植入通道以 3 x 3 矩阵显示每种治疗（行）和 ERP 成分（列），治疗对 ERP 振幅的抑制或增强作用分别以蓝色或红分别用蓝色或红色表示。左下方插图显示了通道位置，突出显示了 FC 刺激电极以及 FC 和 MC 电极之间的微流控通道。数字表示显著的 p 值（未校正）。

3.4 单次试验ERP分类

在标准离线ERP分析程序中计算ERP总平均值不适合实时运行的神经假体设备。不适合设计为实时运行的神经假体设备。因此，我们采用机器学习算法对ERP进行单次试验分类。我们的目的是观察分类器输出的总和是否能准确地区分每个人在每个疗程中接受了哪种治疗。我们对所有治疗方法的一对一组合进行了分类比较，如表 1 所示。我们使用 FC 电极，因为该通道的记录一直很成功，只有一只动物缺少NTX3。此外，已知特定的ERP成分，如N1和P3，会在前中央电极部位达到峰值。数据经过低通滤波并重新采样至 64 Hz，以降低维度，从而减少过度拟合的可能性。由于总平均数据显示由于总平均值数据显示假性记录和 EtOH 治疗之间存在明显差异，尤其是 N1 和 P3，因此根据假性记录和治疗之间的电压差异，选择这些成分的时间窗中的时域数据进行特征提取。接下来、如图 5 A 所示，生成ERP 差异试验，以表示在特定条件下对标准声音和异常声音反应的对比。为了训练一个模型来预测特定动物在特定疗程中应用的治疗方法，所有其他动物的所有差异试验都被合并在一起形成训练数据。因为这些试验可能会使结果产生偏差，并降低训练模型的通用性。测试动物在特定处理下的差异试验被用作测试数据。接下来，我们进行了逐步线性判别分析（SWLDA），将其作为特征选择和分类的组合策略。SWLDA 以前在处理 P3 数据，包括进行单次试验分类时已被证明在这些领域非常有效。生成推定特征集的目的是找到能对两类训练数据进行最佳分离的特征集。从一个空模型开始，每一步都有系统地在模型中添加或删除单个特征，直到模型无法进一步改进为止。如图 5 B模型 所示，在这一阶段，模型中的特征被用作选定的特征集。然后，对逐步选定的特征进行线性判别分析，将给定会话中的每个测试试验归入治疗 A 或治疗 B（图 5 C）。最后，通过简单的多数来预测该环节的整体。

如图 5 D 所示。表 1 列出了对每种治疗类型进行一对一比较时预测的准确性。将假状态与 3 克/千克乙醇治疗进行比较时，94.4% 的疗程预测出了正确的治疗方法，只有一次错误分类。此外，电刺激诱导的大脑状态与所有其他状态的正确区分率高达 100%（低 EtOH 剂量）。在每次比较中，至少有三分之二的疗程对 NTX 药物治疗进行了正确分类。报告每次治疗对比预测结果的情况表见补充表 S 15 - S 29。

图5. 区分每个疗程所用治疗方法的方法。(A) 针对单个动物和治疗方法生成的ERP差异试验。上行（红色）：偏差ERP反应，包括平均值（右）。中行：标准 ERP 反应，包括平均值（左）。下行：结果差异试验。未用于分类的时间范围以浅灰色模糊显示。(B) 逐步特征选择阶段的结果示例，代表一个模型，用于测试动物的疗程是否能正确分类为 “高酒精 ”和 “假 ”治疗。绿色实线：所有差异试验的平均值。棕色实线：“酒精浓度高 ”处理下所有差异试验的平均值。这些线上下的阴影区域代表 1 个标准误差。每个单个代表每次试验中特定时间点的电压。例如，蓝色虚线突出显示的特征代表刺激后 388 毫秒时每次试验的电压。不符合分类条件的时间范围以浅灰色遮盖。未被选中的特征以深灰色遮盖，并在上方打上叉号。被选中用于分类模型的特征在上方打勾。最后一个上一次逐步特征选择迭代中报告的 p 值与每个特征的包含或排除状态一并报告。(C) 线性判别分类器的简化示例，用于将每个试验归类为特定治疗类型的结果。为直观起见，在 B 部分所示的特征选择示例中提取了 p 值最小的两个特征，并提取了与这两个特征最接近的 100 个样本。并显示最接近每个类别算术平均值的 100 个样本。绿色圆圈：来自 “假 ”治疗的样本。棕色三角形：来自 “高酒精 ”处理的样本。超平面用黑色虚线表示。测试样本示例显示为蓝色星形。由于该样本位于超平面的右下方超平面，因此被正确分类为 “酒精含量高 ”样本。(D) 模型做出的整体分类。在每次测试试验（如 A 部分中生成的试验，并使用 B 部分中选择的特征进行 C 部分中的测试）之后，该示例中的大多数试验都被归类为 “酒精含量高”。因此为 “酒精含量高”。

表1. 一比一治疗类型比较中准确预测治疗的疗程百分比。

3.5 植入材料和应用处理的生物相容性

最后，我们研究了植入四周后设备本身的生物整合情况以及综合干预措施对脑组织的影响。这包括应用神经胶质纤毛酸性蛋白（GFAP）和离子化钙结合适配分子 1（Iba1）抗体对神经炎症进行免疫组化评估，以及对层粘蛋白和血小板内皮细胞粘附分子（又称分化簇 31（CD31））进行染色，以揭示脑血管的完整性。我们还使用针对神经元标记物六核苷酸结合蛋白-3（NeuN）和半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（caspase3）的抗体进一步研究了神经元细胞的存活情况。

对三个实验组进行了免疫染色：1）无植入物的假手术动物（n = 3）；2）接受无功能假植入物的动物（n = 3）；3）接受注射乙醇、电刺激和 NTX 给药的有活性植入物的大鼠（n = 7）。每次荧光染色均在每个大脑的六张切片上进行。在随后的图像分析中，我们定义了一个感兴趣区（ROI），该感兴趣区覆盖整个植入物宽度和皮层，深度达 2 毫米（图 6 A）。左侧运动皮层内的免疫反应，位于刺激电极旁边的前囟前 3.2 毫米处。染色面积百分比、每平方毫米染色物体计数和平均荧光强度是每只动物脑切片的平均值，用于统计分析（图 6 C，表 S 30）。与其他使用心电图植入物的研究一样，我们观察到电极阵列周围的纤维组织导致下方脑组织轻微凹陷。我们观察到治疗组 NeuN 阳性细胞数量较少（F(2,10) = 4.474，p = 0.045），这表明这是治疗的效果，而不是装置造成的，因为与假手术大鼠相比，接受植入假体的动物在染色面积百分比和 NeuN 阳性细胞数量上没有显著差异（图 6 B、C，表 S 30）。各组之间的 GFAP、Iba1 和 caspase3 均无差异，表明假体植入或治疗均未明显诱发炎症或急性细胞丢失（图 6 B、C，表 S 30）。然而，我们观察到脑血管系统中与治疗相关的细胞改变，这表现在与假手术大鼠相比，治疗组动物的层粘连蛋白表达较低（荧光强度：F(2,10) = 8.793, p = 0.021，ROI 的百分比面积：F(2,10) = 7.853, p = 0.042）和植入假体的大鼠（荧光强度：荧光强度：F(2,10) = 8.793，p = 0.021，ROI 面积百分比：F(2,10) = 7.853，p = 0.042：F（2，10）= 7.853，p = 0.020）（图 6 B、C，表 S 30））。

图6. 种植体和治疗组织反应的免疫组化评估。

(A)大鼠大脑和前囟前 3.2 毫米处生物医学植入物的横截面，包括植入物取出后用于生物相容性分析的感兴趣区 (ROI)，放大图见 (B)。(B) 左侧运动皮层前囟前 3.2 mm 处刺激电极旁的代表性显微图像。插图为 50 × 50 微米的正方形。(C) 假手术动物（n = 3）、接受植入假体的大鼠（n = 3）和治疗大鼠（n = 7）每次染色的六片脑片的选定生物耐受性指标均归一化并以平均值 ± SEM 表示。星号表示差异显著（P < 0.05）。

我们建立了一个多模态神经接口，结合机器学习来获取、调节和分类清醒大鼠的 ERP 成分。现有的基于心电图的系统通常侧重于感官运动脑区，而本研究首次提出应用皮质外膜植入来瞄准来自高阶前额叶网络的认知ERP。所应用的工具有可能应用于诊断和治疗神经精神疾病，并为智能闭环神经义肢铺平道路。

定制电极阵列是利用 3D 打印技术制造的，该技术采用机器人控制的软性导电材料沉积技术，可定制植入物布局，使其与 mPFC 上部的表面区域相匹配。我们阵列中的柔性铂硅电极在体外具有较低的阻抗。以前的研究表明电极阻抗在植入后的头几周会增大，但随着时间的延长会减小。同样，在为期 3 周的研究中，我们观察到记录电极在 1 kHz 频率下的阻抗不断增加，但我们没有对更长的植入时间进行测量，以明确我们的设备是否也会出现阻抗下降的情况。我们的设备是否也会出现阻抗下降的情况。与记录电极相比，刺激电极的阻抗较低，因为其表面积较大，并且在整个研究期间保持稳定。这可能是因为电刺激会降低组织界面电阻，从而改善信号质量并降低电极阻抗。电极阻抗降低。这种稳定性使得场电位记录可靠且质量高。

神经精神疾病与前额叶大脑活动紊乱有关，前额叶大脑活动紊乱也会导致 ERP 发生变化。因此，对它们的监测越来越多地被纳入临床常规。我们在声音开始后立即记录了作为听觉感知早期阶段出现在大脑中的 ERPs。健康受试者的ERP随声音特征（如音高、响度）的不同而不同。我们的生物电子植入体能够可靠地测量出罕见异常声音和常见标准声音之间的ERP差异。同样，我们也能成功检测出急性酒精摄入后ERP的剂量依赖性变化。与之前对人类和啮齿类动物的研究一致，服用乙醇会严重影响 N1 分量，表明感觉门控受损和知觉紊乱。

尽管ERPs已被认为是疾病的生物标志物，但对其进行有针对性的监测和调节并不是目前治疗干预的重点。在现实生活中，酒精使用障碍的ERP异常会表现为反应，例如听到打开啤酒瓶的声音或看到有人喝酒。对于成瘾者来说，这些与酒精有关的刺激会极大地吸引注意力，并挑战抑制能力以抵御酒精消费。这些过程也表现为神经活动模式的改变，当应用神经调控来改善行为控制和降低复发风险时，神经活动模式理应恢复正常。使用 tDCS 纠正药物使用障碍中的神经紊乱的首次研究可能会对 N2 和 P3 成分产生积极影响。在我们的研究中，植入驱动的直接皮层刺激成功地增强了大多数通道的 N1、P2 或 N2 成分，表明听觉处理、感觉门控得到改善，对异常刺激的感知得到增强。特别是对于 N1 成分，这种效果在更靠近刺激部位的电极上更为明显。研究人员进一步证明，额叶 N1 可能不仅反映了被动的感官处理，还表明了动机的显著性。反应。因此，调节 N1 成分可影响对刺激激活行为的早期抑制，这与成瘾性疾病有关，因为如前所述，复发是由药物线索诱发的渴求和抑制控制受损引发的。此外，刺激锁定 P2 和 N2 的异常还与吸毒者中断治疗有关，这表明监测和调节这些成分可以预测和影响治疗结果。在这里，P3 成分没有受到刺激的明显影响。然而，在涉及主动行动规划和行为控制的实际任务中，P3 比在这里应用的被动条件下更为明显。在直接向前额叶功能区局部注射 NTX 后，我们观察到 P1 和 N1 的延迟时间有所缩短。P1和N1成分（3微克/微升和30微克/微升）的潜伏期缩短，N1、P2、N2或P3（所有应用剂量）在多个通道的振幅增大，这表明听觉处理得到了改善。虽然 NTX 早在 1984 年就已被批准用于成瘾治疗，但有关 NTX 对电生理参数影响的研究却很少，也没有定论。脑电图研究无法发现全身应用 NTX 对我们感兴趣的 ERP我们感兴趣的 ERPs 的影响。在社交饮酒者的听觉怪球范式中，先前口服的 NTX 会显著降低刺激后 200 - 500 毫秒的晚期负差，这表明 NTX 引起的选择性注意受损。与此相反，通过腹部皮下注射 NTX，长期接受治疗的阿片类药物成瘾者在完成语义记忆任务时，与语言相关的 N4 增加，由此得出结论，NTX 在一定程度上改善了神经功能。

为了自主识别神经调节和药物治疗诱发的大脑状态，单次ERP数据经过了SWLDA机器学习程序。SWLDA 在 P3 相关数据的分类方面有很好的记录，在此再次表现出色。在 18 个疗程中，有 17 个疗程对假定条件和高剂量酒精进行了正确分类，并具有高度统计学意义（p < .001）。有趣的是，对两种不同剂量酒精的施用进行了准确区分，这支持了最近的研究结果，即机器学习方法揭示了 ERP 与酒精使用障碍患者饮酒行为的个体差异相关。在精神分裂症、注意缺陷多动障碍和自闭症中，使用 ERP 成分的机器学习技术也被证明可以将患者与健康对照组区分开来。重要的是，我们的 SWLDA 方法可以识别接受直接皮层刺激的动物。这对闭环神经义肢的开发至关重要，因为闭环神经义肢旨在减少副作用并提高效率。闭环神经修复术旨在减少副作用并提高效率，只有在检测到异常神经活动时才会开启脑刺激，并自适应调整刺激参数，在脑活动恢复正常后立即关闭。除了用于癫痫的 NeuroPaceRNS 系统外，还有一种利用机器学习方法的闭环系统已成功应用于帕金森病的 DBS，该系统可提取显示震颤诱发运动的患者特异性皮质信号，并实时调整刺激电压 。因此，ERPs 和机器学习可支持精神症状诊断，并有助于对个体受试者的疾病进展和治疗结果进行预测，从而实现个性化的优化治疗。

虽然我们已经成功证明了我们的生物医学植入物适用于获取和调节前额叶 ERP，但神经植入物的安全性至关重要。免疫组化分析表明，所用植入材料具有良好的生物相容性，而治疗组动物的皮质形态存在一些差异。需要注意的是，动物接受了酒精、电刺激和局部给药 NTX。因此，我们无法判断所显示的效果是否是由特定的或治疗的相互作用所致。不过，这可能反映了患者接受不同方法综合治疗的临床情况。

免疫反应的差异主要体现在层粘连蛋白上，层粘连蛋白是属于细胞外基质的糖蛋白家族，与血脑屏障和神经元功能有关。因此，检测到的层粘连蛋白表达减少可能也会影响神经元。植入生物医学界面的手术干预伴随着神经和血管损伤以及植入装置的典型异物反应。在这里，为了让 NTX 溶液流入，必须切开硬脑膜，这可能会引起一些血管损伤，导致一些动物体内观察到的层粘连蛋白表达发生变化。不过，血管功能障碍和神经元损失也与酗酒引起的氧化应激有关。研究人员等证实，即使是一次醉酒接触酒精，也会对大脑的分子和细胞产生长期影响。电刺激也能增加血脑屏障的通透性。不过，这种影响是短暂和可逆的。应用 DBS 的研究表明，电刺激可以调节甚至减少神经炎症和细胞凋亡，从而发挥神经保护作用。此外，酒精诱导的神经变性与小胶质细胞和星形胶质细胞表达增强有关。然而，我们并没有观察到治疗组的 GFAP 和 Iba1 免疫反应明显增强。由于 NTX 已被证明具有抗炎和神经保护功能，可抵消药物诱导的星形胶质细胞、小胶质细胞和 caspase3 的活化，我们推测 NTX 可能抑制了反复给药酒精的潜在破坏作用。

四、局限

通过此处应用的被动听觉怪球范例，我们无法明确通过皮质外膜植入进行有针对性的ERP正常化是否能够重建失去的行为控制。这就需要一种实验方法，要求受试者对某些刺激做出积极反应或抑制反应。例如，应用于成瘾模型时，可将刺激与药物的可得性和自我用药配对。这样，植入物就能监测和调节药物线索反应的神经生理学相关性以及相关的药物寻求和消费行为。由于已经有了经过验证的动物模型，这里介绍的实验装置可以直接用于针对各种神经精神疾病的治疗，在这些疾病中，感觉处理紊乱是一个特征，并且与临床症状、整体认知障碍和功能障碍密切相关。

目前，神经测量是在刺激后进行的，其分析是离线进行的。对于医疗设备来说，需要将这些要素结合起来，才能对神经活动进行实时的自主测量、分析和调节。集成可控液体输注装置可能会使大脑皮层给药更简单、更直接、更精确。选择使用机器学习程序来识别不同的治疗条件，是基于这样一个假设：与深度神经网络等更复杂的方法相比，线性分类器在大脑信号分类方面表现良好，因为它们提供了过度拟合的可能性，而这通常是由于可用的数据集相对较小。然而，在这种情况下，训练数据集是由许多动物的试验组成的。如果使用大量的动物群，可能会有足够的训练数据使深度学习成为一种有吸引力的替代方法。在当前的数据集中，刺激电极是所有动物在所有疗程中持续记录的唯一通道。提高通道记录的可靠性可能有利于分类，从而可以利用更多的空间信息。目前的方法依赖于在一组动物身上学习到的模式，然后转移到不同的测试动物身上。然而，众所周知，大脑信号具有可变性。在所有条件下进行更多的测试，可以利用测试动物在其他测试中的校准试验建立一个更好的模型，以便推广到新的环节。有了每种条件下多个疗程的数据，甚至有可能为每只动物建立完全依赖于受试者的模型，这可能有助于提高准确性。

最后，为了分析治疗引起的组织反应，大鼠接受了多种干预措施，这阻碍了将结果分配给特定治疗。应在更长的临床相关植入时间后进行进一步的生物相容性评估，以评估持续性影响。

4.1 电化学阻抗测量

使用配备频率响应分析仪的恒电位仪。铂丝用作对电极，Ag/AgCl 电极用作参比电极。使用 Intan RHD2000 USB 接口系统在每次 ERP 记录会话前进行体内阻抗测量。对电极是一根不锈钢丝，其去绝缘端与固定在顶骨间的微型螺钉相连。

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4.2 动物

本项目中的所有研究均已获得德累斯顿工业大学伦理委员会和萨克森州内政部的批准。实验按照欧盟委员会关于保护用于科学目的的动物的 2010/63/EU 号指令的指导方针进行，并十分注意避免动物遭受痛苦和减少使用动物的数量。

研究涉及 n = 10 只成年雄性 Wistar 野生型大鼠，最初最多 4 只一组。手术后，大鼠被关在单笼中，铺上锯末垫料，并使用 Bed-r'Nest 材料作为富集物。颗粒食物和水可自由供应。饲养室的温度（20 - 22℃）和湿度（40 - 55 %）由12小时自动光暗循环控制，早上6点开灯。手术前，动物通过两周的日常操作适应实验者和记录装置。

4.3 手术

在皮下注射芬太尼（0.005 毫克/千克）、咪达唑仑（2.00 毫克/千克）和盐酸美托咪定（0.135 毫克/千克）到颈部皱褶后，进行植入装置的手术。通过耳针和下颌支架将动物头部固定在立体定向框架内。首先，暴露颅盖和颅缝，然后在颅骨中钻入两枚微型螺钉：第一枚钻在左顶骨中，随后用电缆连接到植入连接器，作为参考；第二枚钻在右额骨中，作为锚定螺钉，以提高固定效果。在冷 PBS 的持续冲洗下，以颅骨前囟为基准，在 -2.6 - 3.2 mm 处缓慢穿刺（6.0 mm，< 1500 rpm）。然后用显微剪刀在微通道出口位置（前囟前 2.2 毫米）附近小心地切开双侧硬脑膜。将植入物置于皮质中央，刺激电极位于前囟前 3.2 毫米处。在植入体上涂抹人工硬脑膜密封剂以封闭钻孔。用牙科水泥将植入体的外部部分固定在颅骨上，然后缝合伤口。手术完成后，动物皮下注射纳洛酮（0.12 毫克/千克体重）、氟马西尼（0.2 毫克/千克）和阿替帕唑（0.75 毫克/千克）以拮抗麻醉。动物在手术后立即和次日接受美洛昔康（1.0 毫克/千克，皮下注射）作为止痛药物。

五、实验程序

心电图记录从术后 3 天开始，使用 Intan RHD2000 USB 接口系统和 RHD2132 以 3 kHz 的采样率进行。放大器芯片（Intan Technologies），通过电缆连接到植入连接器。开始时不进行记录，之后按随机顺序每 3 天腹腔注射 1.5 或 3 g/kg EtOH（20 % v/v，记录前 20 分钟）、电刺激或化学刺激后进行记录。电刺激在记录前 20 分钟，使用计算机接口电流发生器通过前中央电极对 mPFC 进行双相电荷平衡脉冲刺激（阳极 100 µA/ 阴极 80 µA，130 Hz）。对于化学刺激，纳曲酮溶于人工脑脊液（125 mM NaCl、3 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.3 mM MgSO4、1.25 mM NaH2PO4、26 mM NaHCO3、13 mM C6H12O6）中，并在记录前 20 分钟以不同剂量（3、6 或 30 µg/µl）通过植入体微通道以 1 µl 的体积使用。

ECoG 记录设置 用于诱导 ERP 的听觉刺激由自定义编写的 Matlab 脚本（生成，包括频繁（标准：50 毫秒，1 千赫，70 分贝声压级，1200 次 = 87 % 的试验）和罕见（偏差：50 毫秒，2 千赫，80 分贝声压级，180 次 = 13 % 的试验）的正弦波，上升和下降时间均为 5 毫秒，刺激间隔为 1 秒。偏差音至少与一个标准音穿插，以避免两个偏差音先后出现。每次将一只动物放置在啮齿动物吊索中，吊索位于一个电气屏蔽和隔音的测听室中。声音刺激通过扬声器在动物头部正上方 45° 角、距离 40 厘米处以 5 分钟为 5 个区块进行播放。

5.1 数据处理和分析

数据处理使用 Matlab 的 EEGLAB 工具箱 （版本2019.1）进行数据处理。首先，使用 0.1 - 45 Hz 带通 FIR 滤波器（Kaiser 窗口，Kaiser β = 5.65，滤波器长度 54330 点）对数据进行离线滤波。对标准声音和偏差声音的数据分别在刺激开始前-100 至 700 毫秒的时间段内进行分割，并使用这些时间段的刺激前间隔（-100 毫秒至 0 毫秒）进行基线校正。在对单个受试者和所有动物（总平均）的历时进行平均之前，分别根据 400 µV 的 delta 标准识别并排除伪差。ERP峰值潜伏期在目测确认的标准时间间隔内确定（P1：30 - 75 ms，N1：80 - 105 ms，P2：110 - 125 ms，N2：130 - 180 ms，P3：200 - 500 ms）。ERP成分的振幅以峰值潜伏期周围10毫秒时间窗内的平均振幅计算。P2 分量的振幅为 N1-P2 峰峰值振幅，而所有其他分量的振幅均为基线峰峰值振幅。

5.2 ERP 单次试验分类

经过过滤且无人工干预的神经记录文件已对标准声音和异常声音进行了分割，并进一步用于ERP单次试验分类。这一过程是根据前中心电极提供的数据进行的。

5.3 为治疗分类生成数据集

使用最小二乘法线性相位抗混叠 FIR 滤波器对数据进行低通滤波，截止频率为 32 Hz，并将数据降采样至 64 Hz。然后提取 N1（80 - 105 毫秒）和 P3（200 - 500 毫秒）范围内的时域数据，得出每个试验共有 22 个特征时间点。接下来，通过从对异常刺激的每次反应中减去 1.) 对标准刺激的平均反应，以及 2.) 对标准刺激的每次反应中减去对异常刺激的平均反应，生成各个阶段和动物的 ERP “差异试验”。与只使用其中一种方法相比，使用这些方法可以生成更广泛的训练集。为了训练模型以预测特定动物在特定疗程中的治疗情况，所有其他动物的所有差异试验都被合并在一起，形成训练数据集。正在进行分类程序的动物的差异试验将被排除在训练集之外。

5.4 特征选择和分类

时域特征（即预处理后每个时间点记录的电压值）被用作特征选择阶段的输入。SWLDA 特征选择首先是创建一个无特征的初始模型，然后对训练数据进行逐步回归。在每个步骤中都对潜在模型进行回归分析，依次包括或排除每个特征，并得出每个特征的 F 统计量和 p 值。p 值越小，表明特征获益的可能性越大。如果模型中尚未包含的任何特征的 p 值低于 0.05 的进入阈值，那么 p 值最小的特征将被添加到模型中。如果没有添加任何特征，但当前模型中的任何特征的 p 值高于 0.1 的移除阈值，那么 p 值最大的特征将从模型中移除。例如，在开始对给定数据集进行特征选择时，将生成包含每个单独时域特征的新模型，并将每个模型在训练数据上的性能与空集的性能进行比较。如果我们假设某个特征在 t = 250 毫秒时的 p 值最低，且低于 0.05，那么在第一步结束时，仅包含该特征的模型将成为当前模型。在第二步中，将生成包含其他可用特征和 t = 250 毫秒处特征的模型，并将它们在训练数据上的表现与当前模型的表现进行比较。如果 t = 90 毫秒处的特征的 p 值最低，且低于 0.05，则第二步结束时的当前模型将是包含 t = 90 毫秒和 t = 250 毫秒处特征的模型。这些步骤一直持续到模型中没有添加或删除任何特征为止。如果这一过程未能选择出任何特征，则会选择 p 值最小的单个特征。在分类阶段，使用选定的特征对线性判别分析模型进行训练和测试。每个训练试验都表示为 n 维空间中的一个点，以建立模型，其中 n 是所选特征的数量。然后在这个 nd 维空间中拟合一个线性超平面，以最好地分离代表两个类别的两组点。对训练试验次数最少的类别进行超采样，以确保每个类别的训练试验次数相等。使用这种方法，可以对特定训练中测试集中的每个差异试验进行分类。为了获得这些单次试验分类，测试试验被表示为 n 维空间中的一个点。然后，根据会话中所有测试试验的分类器输出结果，进行简单多数票表决，从而得出应用了哪种处理方法的会话级整体分类。这种方法对所有干预措施的一对一组合进行了测试。对于所有治疗方法的比较，每个环节的实际治疗方法和预测治疗方法都被交叉表列出来，形成一个或然表，并对其进行卡方检验。如果奇平方统计量的 p 值小于 0.05，则认为特定治疗比较的分类具有统计学意义。

5.5 免疫组化

对三组动物进行了分析：1.) 接受手术干预但未植入假体的动物（假组，n = 3),2.) 植入无功能假体的大鼠（假组，n = 3）；3.注射乙醇、电刺激和输送 NTX（治疗，n = 7）。植入 4 周后，用 PBS 和多聚甲醛（PFA）对大鼠进行灌注，提取大脑并在 4℃ 的 PFA 中保存 24 小时。为使组织脱水，大脑在 4℃ 的蔗糖（30%）中保存一周，然后在 -40℃ 的液氮中冷冻 2 分钟。大脑在-80℃下保存，直至进一步处理。用显微切片机将大脑切成厚度为 40 µm 的切片，并在-20℃ 的抗冻培养基中自由浮动，直至进行免疫组化染色。染色采用双重染色法。每个大脑每次双染色使用六张切片。第一张切片来自前囟前 3.2 mm 处的刺激电极下方。连续切片总是相隔 24 片，覆盖植入物下方的整个区域。切片按照自由浮动切片的标准染色方案进行染色。每个步骤之前都要用 PBS 冲洗多次。切片在含有 0.3 % Triton X-100 和 10 % 血清的 PBS 中阻断 2 小时，然后在 4℃ 下用阻断液中的一抗（表 S 31）孵育过夜。翌日，用封闭液中的二抗和荧光染料（表 S 31）孵育切片 2 小时，然后用 Mowiol 装片。

使用蔡司 AxioScan.Z1 数字幻灯片扫描仪以 10 倍放大率采集脑切片的荧光图像。使用图像处理套件 Fiji (85) 进行图像分析。首先对图像进行背景校正，然后应用全局阈值提取相关对象（图 S 2）。我们为每个脑切片定义了一个感兴趣区，该感兴趣区覆盖整个植入物宽度和深度达 2 毫米的所有皮质层。免疫染色的密度（每个感兴趣区染色面积的百分比，计数/平方毫米）和六片脑片每次染色的平均荧光值代表了动物皮层对植入物和治疗方法的免疫反应性。

5.6 统计分析

使用 SPSS进行统计分析。对未治疗动物的初始 ERP 数据进行了单样本 t 检验，检验结果为差异曲线（偏差减去标准值）与零值之差。治疗诱导的神经活动调节采用双尾配对 t 检验（α = 0.05），对每种治疗与假治疗条件进行分析。得出的 p 值使用 Benjamini-Hochberg 程序进行多重比较的事后校正（考虑到 9 个通道中的假阳性），阈值为 5%，并额外报告为 FDR 调整后的 p 值。效应大小使用 Cohen´s d 计算，平均值的差异除以标准差。免疫组化研究的统计分析包括单因素方差分析和 Holm-Sidak 事后检验，比较假手术动物、植入假体的大鼠和治疗条件下的染色对象数量、染色总面积百分比和荧光强度。效应大小用 Cohen´s f 。

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